食品中牛磺酸检测 GB 5009. 169第一法测试
牛磺酸是一种含硫β-氨基酸,是人体必须的氨基酸之一,具有广泛的生理学作用,作为添加剂多用于药物与食品中.文章了测定牛磺酸的主要方法,包括气相色谱法,薄层色谱法,高效液相色谱法及衍生化高效液相色谱法,氨基酸自动分析法等方法.
牛磺酸，化学名为2-氨基乙磺酸，俗称牛胆碱，是一种存在于动物体内的含硫非蛋白氨基酸[1-2]。牛磺酸曾经被认为是含硫氨基酸的无功能代谢产物[3]，直到1975年Hayes等[4]报道，采用以酪蛋白为主要蛋白来源的饲料饲喂猫，因其缺乏牛磺酸，可引起猫的视网膜变性，若长期缺乏，可导致猫失明，从而引起了人们对牛磺酸营养作用的高度重视。
研究表明，牛磺酸对生长发育有一定影响，是人体条件性必需氨基酸[5]，具有促进脂肪和脂溶性物质吸收、提高机体免疫力、促进生长及保护细胞、改善心肌缺血损伤及促进蛋白质、氨基酸、糖代谢等生理学功能[6-8]，适量的牛磺酸能促进机体的激素分泌，增强和改善机体的各种功能，是调节机体正常活动的活性物质，而缺乏牛磺酸会导致多种疾病的发生[9]。基于牛磺酸的重要生理功能，准确检测各类食品中牛磺酸的含量对指导营养的均衡摄入具有重要意义。
天然食品中，海洋动物的牛磺酸含量较高，猪肉、牛肉、鸡肉等畜禽肉中牛磺酸含量较丰富，鸡胚中牛磺酸含量约为哺乳动物的100倍[10]。食品中牛磺酸的检测方法主要包括液相色谱法[11-16]、氨基酸分析仪法[17-18]、离子色谱法[19]、分光光度法[20]和液相色谱-串联质谱法[21-24]等;而对于药物[25-26]、大鼠血液及组织[27-29]等不同基质中牛磺酸的检测方法研究，国内外也有相关报道。在众多检测方法中，*常用的方法为高效液相色谱法，但因牛磺酸的紫外吸收较弱，常采用衍生化方法提高检测灵敏度，而衍生化反应操作较繁琐，要求较高，影响因素较多。本研究旨在利用高效液相色谱-串联质谱仪建立一种操作简便、检出限低、灵敏度高、定性及定量准确的牛磺酸含量检测方法，以满足猪肉和猪肉制品中牛磺酸含量的准确定性及定量。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
猪肉、猪肉圆火腿为市售。
牛磺酸标准物质（100 mg，纯度≥99.6%） 中国标准物质中心;乙腈（质谱纯）、乙酸铵（质谱纯）美国Fisher公司;亚铁***、乙酸锌、正己烷 天津市科密欧化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
Xevo TQ MS高效液相色谱-串联质谱仪、BEH-C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7μm）、BEH-HILIC色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm） 美国Waters公司;BSA224S电子天平瑞士Mettler Toledo公司;5200DE数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;VX-III多管平行振荡器北京Targin公司;JW-3021HR离心机 安徽嘉文仪器装备有限公司;MS 3 basic涡旋振荡器、高速分散机德国IKA公司;0.22 μm微孔滤膜（有机相） 天津市津腾实验设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 标准溶液的配制
牛磺酸标准储备液（1.0 mg/mL）：准确称取10 mg（**至0.1 mg）牛磺酸标准物质于10mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，摇匀。
牛磺酸标准中间溶液（10 μg/mL）：准确吸取1.0 mg/mL牛磺酸标准储备液1 mL于100mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，摇匀。
牛磺酸标准工作溶液：准确吸取一定量的10μg/mL牛磺酸标准中间溶液，用体积分数75%乙腈水溶液稀释成质量浓度分别为1、5、10、20、50、100、200、500、1000 ng/mL的标准工作溶液，现配现用。
1.3.2 高效液相色谱条件
BEH-HILIC色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），柱温40 ℃，流动相A为超纯水，流动相B为乙腈，流速0.40mL/min，进样量2 μL，流动相及梯度洗脱条件见表1。
1.3.3 质谱条件
电离模式：电喷雾离子源（electrosprayionization，ESI）负离子模式（ESI-）;检测模式：多反应监测（multiple responsemonitoring，MRM）模式;毛细管电压2.8 kV;离子源温度150 ℃;干燥气流量950 L/h;干燥气温度450℃;锥孔反吹气流量40 L/h，MRM监测条件如表2所示。
1.3.4 样品处理
1.3.4.1 样品提取
准确称取经绞肉机搅碎处理均匀的样品2 g（**至0.001 g）于50 mL离心管中，加入20 mL约40℃的温水[13]，采用高速分散机处理约0.5 min，使其完全分散，涡旋振荡提取10 min，将离心管中的样品转移至100mL容量瓶中，用约50 mL 40 ℃左右的温水分2～3 次洗涤离心管，洗涤液合并转入100 mL容量瓶中，超声提取10min，待样液冷却至室温后用水定容至100 mL，移取10 mL定容液于另一50 mL离心管中，加入10mL水饱和正己烷，涡旋振荡混合5 min，于4 ℃、7 000 r/min离心5 min。
1.3.4.2 样品净化
准确吸取1 mL离心后下层清液于15 mL离心管中，加入3 mL乙腈用以沉淀蛋白质，涡旋振荡混匀1 min，7 000r/min离心5 min，吸取1 mL上清液过0.22 μm有机滤膜，滤液供高效液相色谱-串联质谱仪测定。
1.4 数据处理
采用与高效液相色谱-串联质谱仪配套使用的数据采集和处理一体化软件MassLynxV4.1（美国Waters公司）进行实验数据的采集和实验结果的自动处理，经软件自动处理得到试样溶液中牛磺酸的质量浓度，按式（1）计算试样中牛磺酸含量。
（1）
式中：X为试样中牛磺酸含量/（mg/100 g）;ρ为从标准工作曲线得到的试样溶液中牛磺酸的质量浓度/（ng/mL）;
V为样液*终定容体积/mL;m为试样质量/g。
2 结果与分析
2.1 质谱条件优化
采用10μg/mL牛磺酸标准溶液通过蠕动泵注射至离子源，分别在ESI+模式和ESI-模式下进行全扫描，结果表明，牛磺酸在ESI-模式下的响应值明显高于ESI+模式，且因牛磺酸含有磺基结构，在ESI-模式下，较易失去H形成较为稳定的[M—H]-分子离子，选择ESI-模式。确定离子模式后，分别选择全扫描和子离子扫描模式，获得牛磺酸的母离子扫描图谱（图1）和特征碎片离子扫描图谱（图2），选择离子丰度*强的碎片离子对为定量离子对，离子丰度相对较强的离子对为定性离子对，对其毛细管电压、碎裂电压和碰撞能量等条件进行优化，优化后的质谱条件如1.3.2节所示。
2.2 高效液相色谱条件优化
采用优化后的质谱条件（1.3.2节），对比BEH-C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7μm）与BEH-HILIC色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）对10 ng/mL牛磺酸标準溶液的分离效果。
当使用BEH-C18柱进行分离时，牛磺酸的保留效果不好，出峰过快（约0.3min），且峰型严重不对称，这可能是牛磺酸极性较强所致，更换不同流动相，添加甲酸铵、乙酸铵等峰型改善剂，调整不同流动相的洗脱梯度，牛磺酸仍无法得到较好保留和相对较优的峰型。
当使用BEH-HILIC柱进行分离时，因HILIC柱装填了中性的酰胺键合基团，提高了其对强极性、水溶性碱性有机物的保留能力，其对脂肪类物质基本不保留，从而可有效去除基质效应的影响，当采用乙腈、超纯水作为流动相时，其对牛磺酸有较好的保留，且色谱峰峰型对称、美观，灵敏度高。
采用优化后的高效液相色谱条件（1.3.1节）和质谱条件（1.3.2节）测定10 ng/mL和1ng/mL牛磺酸标准溶液，色谱图分别如图3和图4所示。
2.3 样品前处理条件优化
猪肉及猪肉制品中含有大量的蛋白质和脂肪，若不去除，会给牛磺酸的检测造成一定的基质干扰。去除蛋白质的主要方法有固相萃取法[30-31]和蛋白沉淀法[32-34]，固相萃取法成本较高，净化步骤较为繁琐，而蛋白沉淀法操作简便、快捷，本研究使用蛋白沉淀法对样品进行净化处理。去除肉及肉制品中脂肪一般采用正己烷除脂肪法，本研究采用此法得到了很好的除脂肪效果。
分别选用亚铁***、乙酸锌混合溶液（92 g/L亚铁***、183g/L乙酸锌体积比1∶1混合）和乙腈作为沉淀剂。当采用亚铁***和乙酸锌混合溶液作为沉淀剂时，利用亚铁***和乙酸锌反应生成的氰亚铁酸锌沉淀挟走或吸附干扰物质，与蛋白质共沉淀而达到净化目的，净化效果较好，基本可消除基质干扰，测定猪肉及猪肉制品中牛磺酸含量时，加标回收率可达80%以上，但本研究选用的色谱柱为BEH-HILIC柱，采用纯水相作为上机定容液时，对色谱柱的填料有一定破坏作用，且因溶剂效应，导致色谱峰的对称性变差，峰型变宽。而采用乙腈作为沉淀剂时，乙腈可降低水的介电常数，导致具有表面水层的生物大分子脱水聚集后沉淀析出，对蛋白质具有很好的沉淀效果，其净化效果好，可消除基质干扰，测定猪肉及猪肉制品中牛磺酸含量时，加标回收率可达90%以上，且采用体积分数75%乙腈-水溶液作为上机定容液时，对BEH-HILIC色谱柱的填料无破坏作用，无溶剂效应，峰型窄而尖锐对称。选择乙腈作为蛋白沉淀剂。