人体接触产品细胞毒性测试

    细胞毒性是由合成化合物、细胞自然产生毒性或免疫调节细胞(如细胞毒性T淋巴细胞,自然杀伤细胞等)引起的细胞杀伤事件。目前主要通过对受损细胞释放的相关底物(如乳酸脱氢酶-LDH)进行定量,从而判断细.胞膜的受损情况。本期，将为大家讲解有关细胞毒性的检测产品、原理及特点等内容

 细胞毒性检测(乳酸脱氢酶）是稳定的胞浆酶，存在所有的细胞中，当胞膜损伤时快速释放到细胞培养液中。LDH活性通过两个酶催化反应：LDH氧化乳酸盐生成丙酮酸盐，丙酮酸盐和四唑盐INT反应生成甲（formazan）结晶。甲（formazan）结晶量在培养液中的增加，与裂解的细胞数增加直接相关。甲（formazan）结晶染料是水溶的，可以用分光光度计在500nm波长检测。通过检测细胞培养上清中LDH的活性，可判断细胞受损的程度此分析灵敏、方便、**，适用于许多种细胞毒性分析。此分析大概需0.5－1h。

检测方法：试剂：该检测方法一般有配套的试剂盒，以400T的试剂盒为例，包括以下试剂：Components，400assays，Catalyst(Lyophilized)，DyeSolution，1 vial，45 ml

工作液的制备：

a. 用ddH2O溶解催化剂（Catalyst）10min，充分混匀。催化剂溶液4℃可保存数周。

b. 染色液（Catalyst）4℃可保存数周。

c. 反应混合液的制备：分析100 assays，混合250ul催化液和11.25ml染色液。混合液现配现用。

细胞毒分析步骤 

（1）收集细胞，用1×分析液（如，1％血清或1％BSA培养液）。

（2）在96孔板中分别制备下列样本：

背景对照：每孔加200ul培养液，3个复孔。背景值应从其他值中减去。

低对照：向每孔200ul分析液中加1－2×104细胞，3个复孔。

高对照：向每孔200ul含1％Triton X-100的分析液中加1－2×104细胞，3个复孔。

检测样本：向每孔200ul含检测物质的分析液中加1－2×104细胞，3个复孔。

（3）在培养箱中（5％CO2,90%湿度，37℃）孵育细胞，孵育时间为检测物质的适当处理时间。

（4）离心细胞250g，10min。

（5）每孔小心转移100ul上清到相应的优化清洁96孔板中。

（6）每孔加入100ul反应混合液，室温孵育30min。避光操作。

（7）用微孔读板仪在490－500nm检测所有样本的吸光值。参考波长大于600nm。

5. 计算细胞毒的百分比：

细胞毒（％）＝（检测样本－低对照）/（高对照－低对照）%