广州食品中烟酸、烟酰胺测试服务
烟酰胺又称尼克酰胺,是烟酸的酰胺化合物。为白色的结晶性粉末;无臭或几乎无臭，味苦;略有引湿性。在水或乙醇中易溶,在甘油中溶解。临床
上主要用于防治糙皮并口炎、舌炎，病态窦房结综合征，房室传导阻滞等问题。
检测可以根据GB 5009.89-2016 食品安全国家标准食品中烟酸和烟酰胺的测定，来检测食品中的烟酰胺含量。
食品中烟酸和烟酰胺的测定
范围
本标准规定了食品中烟酸和烟酰胺的测定方法。
本标准第一法为微生物法, 适用于各类食品包括以天然食品为基质的强化食品中 烟酸和烟酰胺总
量的测定; 第二法为高效液相色谱法, 适用于强化食品中烟酸和烟酰胺的测定。
第一法
微生物法
原理
烟酸(烟酰胺)是植物乳杆菌 Lactobacill μ s plantar μ m ( ATCC8014 ) 生长所必需的营养素,在一定
控制条件下, 利用植物乳杆菌对烟酸和烟酰胺的特异性, 在含有烟酸和烟酰胺的样品中生长形成的光密
度来测定烟酸和烟酰胺的含量。
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试剂和材料
除非另 有说明, 本方法所用试剂均为分析纯, 水为 GB / T6682 规定的二级水。 培养基可购买符合
测试要求的商品化培养基。
3.1
菌种
植物乳杆菌 Lactobacill μ s plantar μ m ( ATCC8014 ), 或其他有效标准菌株。
3.2
试剂
3.2.1
盐酸( HCl )。
3.2.2
氢氧化钠( NaOH )。
3.2.3
氯化钠( NaCl )。
3.2.4
浓硫酸( H 2 SO 4 )。
3.2.5
乙醇( C 2 H 5 OH )。
3.3
试剂配制
3.3.1
盐酸溶液( 1 mol / L ): 吸取 83 mL 盐酸, 于 1 000 mL 烧杯中, 加 917 mL 水, 混匀。
3.3.2
盐酸溶液( 0.1 mol / L ): 吸取盐酸溶液( 3.3.1 ) 10 mL , 加水溶解至 100 mL 。
3.3.3
氢 氧 化 钠 溶 液 ( 1 mol / L ): 称 取 40 g 氢 氧 化 钠 于 1 000 mL 烧 杯 中, 加 水 溶解 并 稀 释 至
1000 mL , 混匀。
3.3.4
氢氧化钠溶液( 0.1 mol / L ): 吸取氢氧化钠溶液( 3.3.3 ) 10 mL , 加水溶解至 100 mL 。
3.3.5
生理盐水( 0.9% ): 称取
9 g
氯化钠, 溶解于 1 000 mL 水中, 分装 10 mL 于试管中, 121 ℃ 灭菌
15 min , 备用。
3.3.6
乙醇溶液( 25% ): 量取 200 mL 无水乙醇与 800 mL 水混匀。
3.3.7
硫酸溶液( 1 mol / L ): 于 2 000 mL 烧杯中先注入 700 mL 水, 吸取 56 mL硫酸沿烧杯壁缓慢倒
入水中, 用水稀释到 1 000 mL 。
3.4
培养基
3.4.1
乳酸杆菌琼脂培养基: 可按 A.1 配制。
3.4.2
乳酸杆菌肉 汤培养基: 可按 A.2 配制。
3.4.3
烟酸测定用培养基: 可按 A.3 配制。
注: 一些商品化合成培养基效果良好, 商品化合成培养基按标签说明进行配制。
3.5
标准品
烟酸( C 6 H 5 NO 2 ): 纯度 ≥99 .5% , 或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.6
标准溶液配制
3.6.1
烟酸标准储备液( 0.1 mg / mL ): **称取 50.0 mg 烟酸标准品, 用乙醇溶液溶解并移至 500 mL
容量瓶中, 定容, 混匀于 2 ℃ ~4 ℃ 冷藏。 此溶液每毫升相当于 100 μ g 烟酸。
3.6.2
烟酸标准中间液( 1
μ g / mL ): 准确吸取 1.0 mL
烟酸标准储备液( 3.6.1 )置于 100 mL 棕色容量瓶
中, 用乙醇溶液稀释并定容至刻度, 混匀于 2 ℃ ~4 ℃ 冷藏。 此溶液每毫升相当于 1 μ g 烟酸。
3.6.3
烟酸标准工作液( 100 ng / mL ): 准确吸取 5.00 mL 烟酸标准中 间 液( 3.6.2 ) 置于 50 mL容量瓶
中, 用水稀释定容至刻度, 混匀于 2 ℃ ~4 ℃ 冷藏。 此溶液每毫升相当于 100 ng 烟酸。
4
仪器和设备
4.1
天平: 感量分别为 0.01 g 和 0.1 mg 。
4.2
均质设备: 用于试样的均质化。
4.3
恒温培养箱: 36 ℃ ±1 ℃ 。
4.4
涡旋振荡器。
4.5
压力蒸汽消毒器: 121 ℃ ( 0.10 MPa~0.12 MPa )。
4.6
离心机: 转速 ≥2 000r / min 。
4.7
pH
计: 精度 ±0.01 。
4.8
分光光度计。
4.9
超净工作台。
4.10
超声波振荡器。
注: 玻璃仪器使用前, 用活性剂(月 桂磺酸钠或家用洗涤剂 加入到 洗涤用 水中 即 可) 对硬玻璃测 定管及其他必要的
玻璃器皿进行清洗, 清洗之后烘干, 于 170 ℃ 干热 3 h 后使用。
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分析步骤
5.1
储备菌种的制备
将菌种植物乳杆菌 Lactobacill μ s plantar μ m ( ATCC8014 )转接至乳酸杆菌琼脂培养基中, 在36 ℃
±1 ℃ 恒温培养箱中培养 20 h~24 h , 取出 后放入 2 ℃ ~4 ℃ 冰箱中保存。 每月 至少传种一次, 作为储
备菌株保存。
实验前将储备菌株接种至乳酸杆菌琼脂培养基中, 在 36 ℃ ±1 ℃ 恒温培养箱中培养 20 h~24 h 以
活化菌株, 用于接种液的制备。 保存数周以上的储备菌种, 不能立即用作接种液制备, 实验前宜连续传
种 2 代 ~3 代以保证菌株活力。
5.2
接种液的制备
试验前一天, 从乳酸杆菌琼脂培养基移取部分菌种 于灭菌的 10 mL 乳酸杆菌肉 汤培养基中, 于
36 ℃ ±1 ℃ 恒温培养箱中 培养 6 h~18 h 。 在无菌条件下离心该培养液 15 min , 倾去上清液。 加 入
10 mL 已灭菌的生理盐水重新分散细胞, 于旋涡混合器上快速混合均匀, 离心 15 min , 倾去上清液。 重
复离心和清洗步骤三次。 以第三次细胞分散液中吸取 1 mL 加入 10 mL 已灭菌的生理盐水, 使其充分
混合均匀制成混悬液, 备用。 用 721 分光光度计, 在 550 nm 波长下, 以 0.9% 生理盐水为参比, 读取该
菌悬液的透光值, 用 0.9% 生理盐水或第三次细胞分散液调整透光值, 使其范围在 60%~80% 之间。 立
用。
5.3
试样制备
谷薯类、豆类、坚果(去壳)等试样需粉碎、研磨、过筛(筛板孔径 0.3 mm~0.5 mm ); 乳粉、米粉等试
样混匀; 肉、蛋、鱼、动物内脏等用打碎机制成食糜; 果蔬、半固体食品 等试样需匀浆混匀; 液体试样用前
振摇混合。 如不能马上检测, 于 4 ℃ 冰箱保存。
5.4
试样提取
准确称取约烟酸试样, 一般乳类、 新鲜果蔬试样 2 g~5 g (**至 0.01 g ); 谷类、 豆类、 坚果类、 内
脏、生肉 、干制试样 0.2 g~1 g (**至 0.01 g ), 液态试样
5 g
; 乳粉、米粉等准确称取适量试样
2 g (**
至 0.01 g ); 一般营养素补充剂、复合营养强化剂 0.1 g~0.5 g ; 食品 0.2 g~1 g ;液体饮料或流质、半流质
试样 5 g~10 g 于 100 mL 锥形瓶中, 加入被检验物质干重 10 倍的硫酸溶液。 在 121 ℃ 下, 水解 30min
后冷却至室温。 用 0.1 mol / L 氢氧化钠溶液调
至 6.0~6.5 , 再用 0.1 mol / L 盐酸调
至 4.5±0.1 ,
用水定容至 100 mL , 用无灰滤纸过滤, 滤液备用。
5.5
稀释
根据试样中烟酸含量用 水对试样提取液进行适当 稀释( f ), 使稀释后试样提取液中 烟酸含量在
50.0 ng ~500.0 ng 范围内。
5.6
测定系列管制备
5.6.1
标准系列管
取试管分别 加 入烟酸标准工作液 0.00 mL 、 0.5 mL 、 1.0 mL 、 1.5 mL 、 2.0 mL 、 2.5mL 、 3.0 mL 、
4.0 mL 和 5.00 mL , 补水至 5.0 mL , 相当 于标准系 列 管中 烟酸含量为 0.0 ng 、 50 ng 、100 ng 、 150 ng 、200 ng 、 250 ng 、 300 ng 、 400 ng 、 500 ng 。 加 5.0mL
烟酸测定用培养基, 见表 1 。 混匀。 每个标准点应制
备 3 管。