眼刺激性测试试验在农药、兽药、化妆品、洗化用品、新化学品等化学品的登记注册、新品研发、质量检测等领域属于常见的毒性检测资料之一。由于这些化学品对眼睛的刺激性伤害，不仅会造成眼部损伤，而且可能还会由于局部刺激致使结膜的血管和淋巴管扩张，Zui终引起全身毒副作用。所以想要充分、合理、安全使用化学品，眼刺激性试验就成为评估、测量化学品毒性的重要参考测试内容之一。
一、现有眼刺激试验标准分析
目前我国现行的化学品眼刺激性检测标准体系，主要参考的是美国FDA基于兔眼刺激试验标准而建立起的测试方法。
这种方法学在眼刺激性试验研究初期得到广泛应用，但是随着动物试验的“3R”原则在国际上达成的共识，寻找更科学的体外替代试验方法逐渐成为大家评价化学品毒理学安全性的重要手段。此外在Draize兔眼刺激试验中，靠肉眼观察的主观分析性评价方法很难做到客观与量化，只能在一定程度上进行定性的区分，难以显示出细微差别，也不利于大批量检测和一致性评价。
二、现行眼刺激试验标准列表
我国现行眼刺激试验标准大约共 14 项（如下表），其中国家标准 4 项，行业标准 3 项，团体标准 6 项，地 方标准 1项；化学品检测的标准 3 项，化妆品检测标准 9 项，农药检 测标准 1 项，保健产品检测标准 1 项。
上表中，国家标标准1、2、3、4和地方标准14均是传统的体内 Draize兔眼刺激试验。行业标准5、6、7和团体标准8、9、10、11、12、13均为化妆品的体外替代测试方法，检测对象特定。根据检测原理这些标准可以分为细胞膜损伤检测（5、8、9 、11）、细胞毒性检测（6）和非实验动物组织替代兔眼检测（7、10、12、13）。这些检测方法不能完全模拟眼刺激发生时的机体环境，检测的毒性指标为毒效应的终点指标，无法反映毒作用早期的变化，灵敏度不足。并且这些方法不能反映眼刺激发生的分子机制，有较高的假阳性和假阴性率。因此，本文提出针对化学品可建立通用性、灵敏、准确的基于TRPV1 通道活性检测的眼刺激性测试方法。
三、TRPV1 活性检测技术
TRPV1 是一种对钙离子有高渗透性的非选择性阳离子通道，主要分布于背根神经节和三叉神经节中的神经元。
通常情况下，眼刺激性化学品可以通过激活眼球的感受器，释放炎症介质，使眼球产生刺激性症状，因此可以通过测试这些感受器的活性状态反映受试物的眼刺激性。伴随着三叉神经眼支的感觉神经纤维，TRPV1广泛分布在角膜、虹膜、结膜、泪腺等眼部结构。眼刺激性化学品可激活 TRPV1引起细胞外 Ca2+内流，导致细胞内Ca2+浓度迅速升高。因此，通过测试化学品作用于TRPV1-HEK293细胞后的胞内Ca2+浓度改变，反映 TRPV1活性的实时变化，从而定性地检测化学品的眼刺激性反应。
四、TRPV1 活性试验步骤介绍
本试验采用稳定转染TRPV1的人胚胎肾293细胞为检测对象，固体受试物以Zui大溶解度下的溶液作为受试溶液，液体受试物以原液为受试溶液。TRPV1-HEK293细胞先与Ca2+染料孵育，在470~ 495 nm激发波长下，515 ~575nm范围内以1s的采样间隔采集基础荧光信号F0。测试开始后，先不加样品，连续检测细胞板的基线荧光强度60s，以Zui初10个时间点荧光信号的平均值作为基础荧光强度值（F0）。随后，自动加样并连续检测荧光强度值（F）400 s，检测时间共460s。分别计算每个测试时间点各孔荧光强度F的平均值F和相对荧光强度F/F0，生成时间-F/F曲线。计算时间-F/F0曲线60 s ~300 s的曲线下面积（Area Under Curve，AUC），将AUC值作为钙离子内流效应的衡量指标。