一、高效液相色谱法
有机酸是果、蔬的主要组成分之一。果、蔬中有机酸的种类和含量变化很大。这些变化决定于品种、成熟度、气候条件及其它因素。常用气相色谱法、薄层色谱法、高效液相色谱法来测定有机酸。
方法原理
样品经处理后，直接将样品液注入反相化学键合相色谱体系，用5g·L-1（NH4）2HPO4为流动相，有机酸在两相中分配分离，按照其碳原子数由少到多的顺序从色谱柱中洗脱下来。用紫外检测器（214nm）或示差折光检测器检测并与标准样品比较定量。
主要仪器：高效液相色谱仪配CL色谱柱及紫外检测器、微量注射器。
试剂
（1）酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸等所需测定的有机酸标准样品；
（2）Sep-PAKC18净化柱。
（3）5g·L-|（NH4）2HPO4，用H3PO4调至pH=2.5，经0.45μm微孔滤膜过滤，离心脱气后使用。
（4）0.01mol·L”-NaOH溶液。
操作步骤
（1）有机酸标准溶液的制备。分别取适量有机酸单个标准样，如酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸等于25mL容量瓶中，用0.01mol·L--NaOH溶液溶解后定容，参照表17-1的含量范围配制标准浓度系列。
（2）样品溶液的制备。对于液体样品需经合适倍数稀释，用Sep-PAKC18净化柱处理，收集馏出液，经0.45μm微孔滤膜过滤后备用。对于固体或半固体样品，要将其捣碎，均质后，加入一定量的0.01mol·L-INaOH溶液提取。经离心分离或过滤后收集提取液，用Sep-PAKC18净化柱处理，收集馏出液，经0.45μm微孔滤膜过滤后备用。
（3）色谱条件。
固定相∶C18键合相。
流动相∶5g·L-1（NH4）2HPO4，pH=2.5。
流速∶2mL·min-’。进样量10μL。
检测器∶紫外检测器，214nm，0.1AUFS。
测定和计算
（1）将待测样10μL注入色谱仪，根据其峰高或峰面积设定有关Zui 佳参数如Zui小峰面积。
（2）注入有机酸标准系列溶液10μL，进行色谱分析。
（3）以各标准溶液的保留时间定性。
（4）根据有机酸标准系列溶液各响应值（峰高或峰面积）作一响应值与浓度的标准曲线。
（5）分别注入待测样品10μL，进行色谱分析。
（6）根据各待测样品的响应值，在标准曲线上查出其相应的含量。若高效液相色谱仪配有微处理机，则不必配制系列标准溶液，只要选择与待测分析样品浓度相近的（+10%以内）标准溶液注入色谱仪，仍以保留时间定性，根据标准样品的响应值由计算机计算出校正因子，再由计算机用比例计算法作定量计算。
二、气相色谱法
方法原理
在硫酸的催化下，使有机酸成为丁酯的衍生物，用气相色谱法分别定量。可定量的有机酸有∶甲酸、乙酸、丙酸、异丁酸、正丁酸、乳酸、异戊酸、异乙酸、正己酸、乙酰丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、反丁烯二酸、苹果酸、酒石酸、反丙烯三羧酸以及柠檬酸等。
主要仪器
（1）气相色谱仪。装有氢火焰离子检测器、程序升温装置和自动记录器。
（2）杜。填充100g·kg-'SiliconeDC560、DiasolidL（60～80 目）的∅3mm×2m玻璃柱或不锈钢柱。
（3）电热板。功率50W。
（4）试样前处理用柱。∅10mm×70mm玻璃柱2根。
（5）具塞试管。∅25mm×100mm。
（6）旋转式蒸发器。
（7）滑线变压器。
（8）玻璃器皿。20mL容量瓶、滴定管、移液管、冷凝管。
试剂
（1）离子交换树脂。使用Amberlite（一种人工合成的酚甲醛离子交换树脂）CG120、AmberliteCG4B（或Amberlite IRA410）。
（2）将上述有机酸分别配成已知浓度的标准有机酸，分析时需要的酸的Zui小含量，因酸的种类不同而异甲酸、乙酸等低分子酸为1mg左右苹果酸、柠檬酸等为几毫克；酒石酸如少于10mg便不能获得高精度的分析结果。
操作步骤
（1）试样准备。
蔬菜把样品切成3mm见方，称取25.0g加温水（80℃，部分蔬菜可用800mL·L喜乙醇代替（*）研磨，提取2次，合并提取液，加酚酞指示剂，用0.1mol·L-1NaOH溶液滴定，求总酸量，使有机酸成为钠盐。中和后的溶液，在40℃下用旋转蒸发器浓缩至约15mL，浓缩液移入25mL容量瓶并定容。必要时可过滤除去不溶物。
吸取此提取液10mL（E2）用AmberliteCG120、AmberliteCG4B（*3），得到有机酸组分，将其酯化（注4），供气相色谱分析用（图17-2）。
水果从新鲜水果样品中称取20.0g，加3倍量的800mL·L-乙醇研磨（半5），以离心分离后，收集上清液，残渣再反复提取2次，合并提取液，加酚酞指示剂，用0.1mol·L-1NaOH溶液中和。中和后在80℃恒温水槽中加热10min后，定容至200mL，使用前保存于冰箱中。
取此提取液10～50mL（半6），用旋转蒸发器浓缩至无醇后，依次通过AmberiteCG120、CG4B及CG120柱，得到有机酸组分，加入酚酞指示剂并滴定，求出总酸含量。保存于约40℃下，用旋转蒸发器（注7）浓缩，干涸后进行丁酯化处理。
（2）酯化。用上述方法制备的有机酸中，加丁醇2mL，无水硫酸钠2g，浓硫酸0.2mL，连接冷凝管，在电热板上平稳沸腾（半8）约30min（加热时要不断搅拌），使有机酸成为丁酯。
（3）酯的提取。酯化终了，加水和己烷各5mL，充分混合，使酯转溶于己烷中，每次用己烷5mL提取3次。用移液管移入20mL容量瓶中，容量瓶中事先已装有5g·1-1十九烷（内标）的己烷溶液1mL，用己烷定容。再加无水硫酸钠0.5g，去除混入的微量硫酸。取5μL进行气相色谱分析。
（4）分析。柱子在60℃下保持6min后，以每分钟升温5℃速度升至250℃。氮气、氢气、空气的流量分别为60、50、900mL/min，注入口及检测器的温度为260℃。Sensitivity为10MΩ，Range为0.01V。
（5）工作曲线的制备。将已知浓度的标准有机酸用上述方法制成丁酯后，用气相色谱仪分析，制成标准曲线。