无菌验证分为设备检查、烟雾测试和尘埃粒子测试、染色试验、辅助系统测试、正压罩环境预测试、贴片实验、瓶内、外挑战测试、盖内、外挑战测试、LG培养基预测试、产品测试及LG培养基测试十一步。本文会对瓶内、外挑战测试和盖内、外挑战测试及LG培养基测试三大部分重点讨论。
试验前准备工作，需确保包装物和产品初始菌含量满足要求：
瓶子(新吹的)：<3CFU/瓶内和瓶外；
瓶盖：<20 CFU / 盖；
产品：<100 CFU / ml营养菌；
< 10 CFU / ml耐热孢子；
工艺水：< 50 CFU / 250 ml。
包装容器
空瓶：保证平均灭菌率为log6，是指在瓶子的内部和瓶盖消毒接种杆状菌作为初始带菌量。整个步骤如下：使用移液枪向130个瓶子接种枯草芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus ATCC 9372)孢子悬浮液(载量：每毫升0.1ml/107CFU)并干燥(8到24小时)。注意此处菌体和芽孢数量会随时间和温度损失。
120个瓶子由灌装机灌注无菌水瓶并由旋盖机封盖(以下简称“测试样”)，10个瓶子用于检测初始带菌量(以下简称“阳性对照样”)(为了防止菌体数量过度损失，建议接种浓度要高1个log)。采用端点方法计算-过膜过滤方法确认枯草芽孢杆菌孢子进行评估。结果只受目标菌影响。
瓶内挑战测试：
①选取260个以上完好空瓶；
②用枯草芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus ATCC9372)孢子悬浮液接种空瓶：105和106各130瓶，接种位置依瓶型而定，但尽量选择瓶内凹陷不易杀菌的地方，并充分震荡；
③空瓶正常风干后准备进行测试，以Zui高生产速度，确保Zui短时间也能达到灭菌要求，先低浓度再高浓度，系统需预先调试好，无菌罐中准备好无菌水；
④测试前随机抽取105的10个空瓶到实验室进行阳性对照检查，其方法为，到实验室将空瓶灌装100ml无菌水（预先加入吐温80辅助洗脱），盖上无菌瓶盖（预先去除防盗环并用铝箔纸包好的经121℃*15min湿热灭菌后的瓶盖），充分振荡清洗，然后进行梯度稀释，至少稀释5个梯度，取合适浓度的两个梯度样品，各取1ml进行倒平板，每梯度样品做2~3个平行，依GB4789.2-2016菌落总数混释法进行实验计数，得出空瓶的初始带菌量；
⑤将120个105空瓶手动放入输送带进行杀菌、洗瓶、灌装（灌装100ml无菌水，根据瓶型，为维持设备运转稳定性，可以适当提高灌装量）、封盖，另120个106空瓶重复以上操作；
⑥将灌装好的产品在实验室充分振荡后进行膜过滤培养48小时后得出空瓶杀菌后残留带菌量，注意跟阳性对照实验室区分开；
瓶外挑战测试：
①选取130个以上完好空瓶；
②用枯草芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus ATCC9372)孢子悬浮液接种空瓶：104和105各65瓶，接种位置依瓶型而定，但尽量选择瓶外凹陷不易杀菌的地方，接种后用记号笔在接种部位做好标识；
③空瓶正常风干后准备进行测试，手动挂到输送带进行测试；
④测试前随机抽取104的5个空瓶到实验室进行阳性对照检查，其方法为：到实验室将空瓶接种位置剪开，放入已灭菌好的100ml无菌水的盒子中充分振荡清洗，然后进行梯度稀释，至少稀释4个梯度，得出空瓶外部初始带菌量；
⑤将60个104空瓶经过正常的杀菌程序后，灌装出口放置一次性无菌取样袋。取出空瓶后，到实验室将接种标识位置剪出，放入已灭菌的100ml无菌水的盒子中充分振荡清洗后进行膜过滤，或用已灭菌的棉签来涂抹接种标识位置，将棉签放入已灭菌的100ml无菌水的盒子中充分振荡清洗后进行膜过滤，从而得出瓶外杀菌后残留带菌量。另60个105空瓶重复以上操作；
验证判定：用阳性对照检测的含菌量与杀菌后残留的菌量进行对照，从而判定杀菌力（衰减计数法），带入以下公式：
Log(Rave ) =Log(∑Rc/Nsample)- Log(∑Sc/Ntest)
∑Rc：阳性对照样带菌总数；
Nsample：阳性对照样数量；
∑Sc：测试样残留带菌总数；
Ntest：测试样数量；
Log(Rmin ) =Log(∑Rc/Nsample)- Log(Sc)
Sc：测试样的残留带菌数Zui大样品的菌落数；
Log(Rmin )：Zui低杀菌能力
