氨基酸对动物的生长、神经系统的发育及动物体内营养物质的正常代谢都有重要的作用,蛋白质是动物生长必需的营养物质,是评价饲料营养成分的一种重要物质,而氨基酸是构成蛋白质的基本单位,氨基酸的种类和含量也就是评价饲料质量的根本依据,从而准确检测氨基酸的含量和种类具有重要意义。柱后衍生的方法,准确性高,耗时长、灵敏度低,本文采用柱前衍生的方法以缩短分析时间,增加灵敏度。该方法得到的氨基酸衍生物在-20℃可保存数月,克服了柱前衍生法衍生物不稳定的缺点,该方法准确性高,用标准品做未知样品进行检测,检测的含量与标准品的标示值非常接近。
参考标准:
(GB/T 17817-2010、GB/T 17818-2010、GB/T 17812-2008)饲料中18种氨基酸的测定(柱前衍生HPLC法)
(1) 样品前处理
酸水解法:准确称取一定量的样品,使样品氨基酸总量在50~75mg范围内,置于20~30mL安瓿瓶中,加入10mL含0.1%苯酚的6mol/L盐酸,振摇使样品溶解或者是样品均匀分散在溶液中,将安瓿瓶置于-20℃冰箱中冷冻3~5分钟,充氮后用喷灯熔封,置于110±1℃烘箱中水解24小时,取出冷却,取水溶液1mL,置于浓缩管中用浓缩仪浓缩至干,加入1mL的0.1mol/L稀盐酸溶解,用0.45μm滤器过滤后,取清液贮存于冰箱中,供衍生使用。
(2) 衍生方法
准确量取水解后溶液及氨基酸标准品200μL,分别置于1.5mL离心管中,往每支离心管中准确加入正亮氨酸内标50μL,分别加入三乙胺乙腈溶液100μL和异硫氰酸苯酯乙腈溶液100μL,摇匀室温静置衍生1小时。衍生结束后分别加入400μL正己烷,振摇并静置10min,取下层溶液200μL并用水稀释到1mL,混合均匀后用0.45μm针式过滤器过滤即可。
(3) 检测方法
3.1 溶液配制
流动相A:称取15.2g无水乙酸钠,加水1850mL,溶解后用冰醋酸调pH值到6.5,加乙腈溶液140mL,混合均匀并用0.45μm滤器过滤流动相B:80%乙腈水溶液
3.2 高效液相检测条件